ОЦЕНКЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДИЕТОТЕРАПИИ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА С АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ

УДК 616-053.2-056.3:615.835

Ж.Б.Испаева Т.Б.Сенцова¹, В.А.Ревякина¹, С.Н.Денисова², И.В.Ворожко¹, О.Ю.Моносова¹, О.О.Кириллова¹,

Тимофеева А.М .Сырбаева К.Ж.¹

КазНМУ им.С.Д.Асфендиярова  ,г.Алматы ,¹НИИ питания РАМН, Москва

²Детская городская клиническая больница №9  им. Г.Н.Сперанского, Москва

Оценить динамику растворимых маркеров апоптоза у детей раннего возраста с атопическим дерматитом для уточнения механизмов иммунопатогенеза и оптимизации диетотерапии.

Материалы и методы: под наблюдением находилось 66 детей в возрасте от 1.5 до 12 мес. с атопическим дерматитом (47 мальчиков и 19 девочек) на искусственном вскармливании. При аллергологическом обследовании у всех детей была выявлена сенсибилизация к белку коровьего молока. Наличие аллергенспецифических IgG и IgE  антител к белку коровьего молока, его фракциям и белку козьего молока явилось основанием для включения детей в первую группу детей, которая получала гидролизаты в качестве диетотерапии (27 детей), а 39 детей второй группы — у которых не было выявлено сенсибилизации к белку козьего молока, получали смеси  на его основе. Содержание растворимых маркеров апотоза (sCD153, каспазы-8, sFas-L, каспазы-9 и аннексина-5) в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом (ELISA).

Результаты: Полученные результаты свидетельсвовали об активация сигнальных систем апоптоза у детей с атопическим дерматитом (АтД) за счет повышения уровней sFas-L и sCD153.  Содержание каспаз-8 и -9 было достоверно ниже, чем в контрольной группе, что отражало нарушение в элиминации измененных иммунокомпетентных клеток. Концентрации аннексина-5 были значительно снижены у детей с АтД по сравнению с контрольной группой. Оценивая динамику исследованных показателей у детей с АтД при проведении диетотерапии, отмечено статистически достоверное повышение уровня каспазы-9 в обеих группах. Уровень каспазы-8 повышался только в группе детей использовавших смеси на основе козьего молока. Статистически значимых различий содержания sFas—L, sCD153 и аннексина-5 на фоне диетотерапии не было выявлено в обеих группах.

Заключение: Полученные данные свидетельствовали об участии sCD153, каспазы-8, sFas-L, каспазы-9 и аннексина-5 в реализации аллергическом воспаления у детей раннего возраста с АтД. Диетотерапия с использованием смесей на основе козьего молка способствовала более физиологичному восстановлению эффекторного звена апоптоза.

Ключевые слова: маркеры апоптоза, атопический дерматит, дети.

Согласно современным представлениям апоптоз – это процесс, возникающий в клетке в результате внутреннего или внешнего сигнала определенной интенсивности и развивающийся по типичной для данной клетки программе [1]. В процессе апоптоза сохраняется целостность клеточных мембран и внутриклеточного содержимого, отсутствуют повреждение тканей и лейкоцитарная инфильтрация. В результате апоптоза происходит физиологическая смена клеточных поколений во всех тканях организма, в том числе и в иммунной системе, благодаря чему обеспечивается физиологическое равновесие гомеостаза [2].

Экспериментальными работами последних лет доказано, что активация апоптоза может происходить двумя основными путями: рецептор-опосредованным, при котором индуктором апоптотических изменений выступает комплекс Fas/Fas-L и др., и митохондриальным, за счет высвобождения  цитохромома С и других апоптотических белков – регуляторов митохондриальных событий [3]. При сигналинге опосредованном Fas/Fas-L в результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация каспазы-8 [4]. При высвобождении  цитохромома С, белка Apaf-1 и митохондриальных белков активируется каспаза-9. В дальнейшем каспазы -8 и -9 воздействуют на эффекторные каспазы -3, -6 и -7, что приводит к протеолитическому расщеплению белков клетки [5]. Таким образом, каспаза-8 выступает маркером инициации эффекторного звена апоптоза при рецепторном сигналинге, а каспаза-9 – при митохондриальном [6]. Следует отметить, что рецепторный и митохондриальный пути взаимодействуют и взаимно регулируются [7]. Поэтому в настоящее время процессы апоптоза оцениваются по белкам в зависимости от их преимущественного участия либо во внешнем (рецепторном), либо во внутреннем (митохондральном) пути активации [8].

Доказано, что помимо CD120а, CD95, TRAIL-R1, TRAIL-R2 тригерром апоптоза может выступать белок CD153, также являющийся представителем суперсемейства TNF, и экспрессирующийся преимущественно на активированных Т- , В-клетках и моноцитах [9]. Его растворимая форма (sСD153) c высоким аффинитетом связывается с рецептором СD30, находящимся на клеточной мембране, однако конкретные механизмы приводящие к программируемой клеточной гибели с участием данного рецептора до настоящего времени остаются малоизученными.

В настоящее время установлено, что биологическая роль аннексина-5 при апоптозе неоднозначна. Экспериментальными работами показано, что аннексин-5 попадает во внеклеточное пространство в результате гибели клеток, при этом отсутствует спецефичность его вотношении апоптоза. В терминальных стадиях апоптоза он связывается с белковыми структурами на внешней стороне плазматической мембраны, ингибируя провоспалительную активность клеток, что проявляется повышенными концентрации этого показателя в сыворотке крови [10].

Внедрение в клиническую практику новых методов исследования позволило установить участие апоптоза в патогенезе различных заболеваний [11]. Изучение апоптоза иммунокомпетентных клеток в патогенезе аллергических болезней проводилось с целью определения особенностей его функционирования в реализации аллергического воспаления. В работах последних лет выявлена устойчивость Т-лимфоцитов к апопотозу как в фазе инициации, так и в эффекторной стадии у детей с атопической бронхиальной астмой [12]. Однако, эти данные носят фрагментарный характер, подобные исследования у детей раннего возраста при других видах аллергопатологии не проводились. Тем не менее в экспериментальных работах было установлено, что элиминация аллергенспецифических эффекторных СD8+ T-клеток за счет апоптоза не приводила к развитию аллергического воспаления кожи [13] Поэтому раскрытие роли апоптоза в механизмах реализации аллергического воспаления представляется важным для профилактики и эффективной терапии, в том числе и диетотерапии у детей раннего возраста с АтД.

Цель работы: оценить динамику растворимых маркеров апоптоза при диетотерапии у детей раннего возраста с атопическим дерматитом.

Материалы и методы: в соответствие с целью и задачами работы проведено исследование растворимых маркеров апоптоза у 66 больных раннего возраста с АтД находившихся на искусственном вскармливании. Возраст обследованных детей был от 1,5 до 12 месяцев. Дети от 1,5 до 6 месяцев составили 35 человек (53%) от общего числа детей, дети от 1 до12 месяцев — 31 ребенок (47%). В группе детей от 1,5 до 6 месяцев преобладали мальчики 71,5 %  (25 детей). Среди детей от  полугода до года 53,3 % составили девочки  (16 детей) и 46,7 % мальчики (22 детей). Диагноз атопический дерматит ставился на основании совокупности диагностических критериев, сформулированных на международных согласительных документах [14]. Для оценки степени тяжести атопического дерматита использовалась шкала SCORAD (Severity Scoring of Atopic Dermatitis) [15]. Аллергологическое исследование вклоючало количественное определение аллергенспецифических IgE и IgG антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) к белку коровьего молока (БКМ), казеину, α-лактальбумину (α-ЛА), β-лактглобулину (β-ЛГ) и белку козьего молока в сыворотке крови. Применялись коммерческие тест-системы Allergopharma (Германия).

Содержание sCD153, каспазы-8, sFas-L, каспазы-9 выявлялось с помощью коммерческих наборов для ИФА Bender MedSystems (Австрия), уровень аннексина-5 с помощью коммерческих наборов Biosource (BioSource International Inc, Бельгия). Изучение концентраций sFas-L и sCD153 позволяло охарактеризовать рецепторный путь апоптоза, а каспазы -8 и -9 его эффекторное звено. Определение участия аннексина-5 в реакциях апоптоза было обусловлено его регуляторной ролью. Учет и регистрация результатов проводилась на вертикальном спектрофотометре Sunrise (TECAN, Австрия) с прилагаемым программным обеспечением. Для получения референсных значений растворимых маркеров апоптоза были использованы образцы крови детей в возрасте от 1.5 мес. до 3-х лет проходивших обследование перед малыми хирургическими операциями (грыжи и т.д.). Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом.  Обработка результатов проводилась с использованием пакета статистических программ SPSS (США) для персонального компьютера. В связи с тем, что центральные тенденции и дисперсии имели нормальное распределение, при анализе определяли средние значения признака (M), стандартные ошибки среднего (m), среднеквадратичные отклонения (σ). Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента (t) для независимых и связанных выборок при значениях вероятности р < 0,05. Различия групп расценивались, как статистически значимые при р < 0,05 или высоко значимые при р < 0,01.

Дизайн исследования: Исследование являлось открытым, проспективным. Объектом исследования были дети раннего возраста страдающие АтД, жители московского региона. Критериями включения в исследование являлись: возраст больного (1 – 12 мес.), нахождение на искусственном вскармливании; критериями исключения – участие в другом исследовании, декомпенсированная органная патология,  наличие иного аллергического заболевания, желание родителей пациента. Всем пациентам включенным в исследование после объективного обследования, проводимого для уточнения диагноза и оценки степени тяжести, исследовались аллергенспецифические IgE и IgG антитела в сыворотке крови к БКМ, казеину, α-ЛА, β-ЛГ и белку козьего молока с целью выявления причинно-значимого аллергена. Для определения sCD153, каспазы-8, sFas-L, каспазы-9 и аннексина-5 аликвоты этих сывороток были заморожены (минус 20˚С) до момента проведения анализа   Диетотерапия обследованным детям назначалась с учетом данных аллергологического исследования аллергенспецифических IgE и IgG антител к белку БКМ) казеину, α-ЛА, β-ЛГ и белку козьего молока. На фоне диетотерапии детям проводилась медикаментозная терапия блокаторами Н-1 гистаминовых рецепторов и наружная кожная терапия. По результатам аллергологического обследования были сформированы группы наблюдения: в первую группу вошли дети, которые имели сенсибилизацию к белку коровьего и козьего молока (n=27) , а во вторую — дети, у которых не выявлялась сенсибилизация к белку козьего молока (n=39).  Детям первой группы в качестве диетотерапии назначались смеси на основе гидролизатов коровьего молока, детям второй группы — смеси на основе козьего молока. Повторное наблюдение проводилось на 21 день диетотерапии  и включало аналогичный комплекс иммунологических исследований.

Результаты и обсуждение: Было установлено, что у всех обследованных детей реализация атопического дерматита была обусловлена высокой степенью сенсибилизации к БКМ и его фракциям – казеину, α-ЛА, β-ЛГ. Частота изолированного IgE ответа составляла 52% (34 ребенка), а смешанного  (IgG и IgE) — 48% (32 ребенка). Изолированный IgG ответ не выявлялся ни в одном случае наблюдения.

В проведенном исследовании об особенностях функционирования апоптоза судили по уровням sFas-L, sCD153, каспаза-8, каспаза-9 и аннексина-5 в сыворотке крови. Использованные показатели позволили создать представление, как о процессах сигналинга, так и эффекторных механизмах апоптоза с учетом степени тяжести АтД у детей (таблица № 1). У детей с легким течением АтД была выявлена лишь тенденция к повышению  sFas-L, в то время, как концентрации sCD153 превышали значения контрольной группы при легкой, средней и тяжелой степени АтД (p<0.05). Можно предположить, что процессы сигналинга апоптоза у детей с АтД при реализации аллергического воспаления активированы. При тяжелом течении АтД показатели sFas-L и sCD153 были максимально повышены по сравнению с данными контрольной группы (p<0.05). Иная тенденция прослеживалась при изучении каспазы-8, каспазы-9 и аннексина-5.    Концентрации каспаз-8, -9 у обследованных детей были статистически значимо ниже (р<0,05), чем в контрольной группе. Минимальные значения этих показателей были зарегистрированы при тяжелом течении атопического дерматита. Учитывая в целом неспецифическую регулирующую роль каспаз в поддержке функционального равновесия, выявляемый дефицит в содержании каспаз -8 и -9, свидетельствует  о дисфункции эффекторного звена апоптоза.

Отмечено статистически значимое (р<0,05),  снижение концентрации аннексина-5 у детей с АтД по сравнению с контрольной группой. Учитывая его способность к ингибированию провоспалительной активности  клетки можно предположить деполяризацию иммунного равновесия в сторону аллергического воспаления.

Следовательно процессы апоптоза при развитии АтД имеют свои особенности. С одной стороны активация сигнальных систем значительно повышена, а с другой имеются косвенные признаки недостаточной элиминации измененных клеток, что способствует прогрессированию и хронизации аллергического воспалительного процесса.

Оценивая динамику исследованных показателей у детей с АтД при проведении диетотерапии отмечено статистически достоверное (p  < 0.01)   повышение уровня каспазы-9 в обеих группах ( таблица №2). Уровень каспазы-8 повышался только в группе детей использовавших смеси на основе козьего молока (p < 0.05). Статистически значимых различий содержания sFas-L, sCD153 и аннексина-5 на фоне диетотерапии выявлено не было, хотя имелась тенденция к нормализации исследуемых показателей. Таким образом элиминация причинно значимого аллергена у детей с АтД при проведении диетотерапии приводила к активации митохондриального пути апоптоза. Учитывая тот факт, что при диетотерапии с использованием смесей на основе козьего молока, как одного из видов диетического продукта происходит увеличение содержания, как каспазы-9, так и каспазы-8, можно предположить, что данный вид гипоаллергенной диеты способствует более физиологичному восстановлению эффекторного звена апоптоза. Обобщая результаты проведенных исследований можно заключить, что изучение маркеров апоптоза важно с точки зрения раскрытия иммунопатогенеза АтД и определения их прогностической значимости в процессе проведении диетотерапии у детей раннего возраста.

Таблица 1 — Маркеры апоптоза в сыворотке крови детей с атопическим дерматитом (нг/мл, M±m).

* p<0.05 по сравнению с контролем

Таблица 2 — Содержание sFas-L, sCD153, каспазы-9, каспазы -8 и аннексина-5 в сыворотке крови у детей раннего возраста с АтД в процессе проведения диетотерапии (нг/мл, M±m)

*p < 0.05, и **p  < 0.01 по сравнению с показателем до лечения