В данной обзорной статье рассматриваются основные понятия о мембраносвязанных рецепторах врожденного иммунитета – Толл-подобных рецепторах, основные методы определения их экспрессии, применяемые в клинических исследованиях, а также полученные с их помощью результаты. Перспективы будущих исследований основаны на получении полной информации о функционировании систе­мы TLR, также необходима комплексная оценка всех ее звеньев. Это позволит уточнить и ло­кализовать молекулярные дефекты нарушений в системе врожденного иммунитета, а также оценить их роль в патогенезе широкого круга заболеваний.

 

Индивидуальная восприимчивость организма к инфекциям определяется патогенностью микроорганизмов, факторами окружающей среды и состоянием иммунной системы [1]. Защита на местном уровне после инфицирования осуществляется прежде всего типичной воспалительной реакцией, которая направлена на распознавание и уничтожение патогена и его компонентов. В- и Т-лимфоциты, осуществляющие адаптивный иммунный ответ, распознают патогены, используя высокоаффинные рецепторы. Однако развитие адаптивного иммунитета обычно происходит достаточно медленно, так как предполагает активацию, пролиферацию лимфоцитов и синтез ими белков: цитокинов и иммуноглобулинов. Более быстрое развитие иммунных реакций обеспечивается врожденным иммунным ответом, который распознает патогены при помощи специальных рецепторов более широкой специфичности, чем рецепторы лимфоцитов. Эти рецепторы распознают молекулярные структуры, общие для целых групп инфекционных возбудителей, в первую очередь к ним относятся Толл-подобные рецепторы (TLR). TLR взаимодействуют с молекулярными структурами, которые не существуют у человека, но присутствуют на патогенах [2, 3]. TLR широко распространены в клетках макроорганизма. Они индуцируют активацию и экспрессию специфических генов, экспрессия которых контролирует механизмы,  обеспечивающие деструкцию  внедряющихся патогенов. В результате активации через TLR возникает широкий спектр биологических реакций – от индукции синтеза провоспалительных цитокинов и интерферонов (обеспечивающих реализацию реакций врожденного иммунитета) до экспрессии костимулирующих молекул, которые способствуют активации Т-лимфоцитов и стимулируют развитие адаптивного иммунного ответа [4].

Широкий спектр лигандов TLR и представленность этих рецепторов на многих клетках способствуют вовлечению TLR в патогенез многих забо­леваний. Дефекты в системе TLR, такие как нару­шения распознавания лигандов, экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных мо­лекул, а также полиморфизм генов TLR могут при­водить к развитию тяжелых инфекционных заболе­ваний (сепсис, менингит), аутоиммунных заболе­ваний, атеросклероза, аллергопатологии [5, 6, 7]. Дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от TLR, лежат в основе повышенной чув­ствительности к инфекциям. Так, дети с мутацией в гене, кодирующем IRAK-4-киназу, с раннего воз­раста страдают тяжелыми пиогенными инфекция­ми, вызванными грамположительными микроорга­низмами [8]. В то же время чрезмерная активация сигнального каскада от TLR ассоциирована с раз­витием сепсиса, воспалительных заболеваний ки­шечника, может вызывать деструкцию тканей. Количество выявленных связей различных патологий с нару­шениями в системе TLR растет. В свя­зи с этим необходимы адекватные и надежные методы оценки компонен­тов системы TLR для выявления иммунодефицитных состояний, связанных с нарушениями функциональной актив­ности TLR, которые могут быть вос­произведены в условиях стандартной клинической лаборатории [9].

Определение экспрессии TLR. Экспрессию TLR на поверхности клеток чаще всего определяют с помощью метода иммунофлуоресценции. Принцип этого метода заключается в том, что в нем используются меченные флуоресцентными красителями моноклональные антитела (МКАТ) против CD — маркеров данного типа клеток одновременно с меченными другим флуорохромом МКАТ к изучаемому TLR (метод «двойной метки»). В качестве примера приведем краткое описание метода определения TLR2 и TLR4 на моноцитах при изучении взвеси мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови, приведенных в работе [9].

Для определения экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови выделенные на градиенте фиколл-урографина мононуклеарные клетки ин­кубировали с FITC-меченными антителами к СD14+, РЕ-меченными антителами к TLR2 и TLR4 с соответствующими изотипическими контролями в течение 30 мин при 40С. Анализ экспрессии CD 14+, TLR2 и TLR4 проводили на проточ­ном цитофлуориметре. Оценивали процент моноцитов (CD 14+ -клеток), несущих на своей поверхности TLR2 и TLR4, и среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ), величину которой выражали в условных единицах (усл. ед.) флуоресценции.

Проточная лазерная цитометрия. Подготовку проб для проточной цитометрии обычно проводят следующим образом: ядросодержащие клетки периферической крови выделяют путем осаждения эритроцитов 3% раствором желатина. Перед внесением антител клеточную сус­пензию для исследования экспрессии внутриклеточных TLR предварительно обрабатывают фиксирующим пермеабилизирующим раствором. Изучение экспрессии поверхностных TLR не требует обработки этим раствором, поскольку TLR1, 2, 4, 6 и 10 являются преимущественно мембраноассоциированными. Обработка вторичными анти-мышиными антителами, меченны­ми FITS или РЕ, также должна соответствовать общепринятым стан­дартам. В качестве изотипического контроля цитометрических замеров используют IgG-фракцию от неимунизированных мышей. Конечная концентрация для анализа составляет 2х106 клеток/мл. Проточную лазерную цитометрию проводят на приборе с аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Цитограммы исследуемой кле­точной взвеси выводят на основе регистрируемых параметров малоуглового светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC) в режиме dot-plot. Анализ интенсивности флуоресцен­ции и процента флуоресцирующих клеток проводят в зеленой области (FITS) FL1 (530 нм) и оранжевой области (РЕ) FL2 (585 нм). Клетки анализируют в лучах аргонового лазера при скорости потока 5000 клеток/с. Среднюю интенсивность флуо­ресценции клеток выражают в условных единицах флуоресцен­ции (УЕФ) [10].

Уровень экспрессии мРНК генов TLR обычно определяют методом ПЦР в режиме «реального времени» (РВ), совмещенной с обратной транскрипцией с ис­пользованием специфических праймеров. Например, экспрессия генов TLR2 и TLR4 может быть осуществлена с помощью следующих праймеров:  к TLR-2 – TLR2-F1-CCTТCACTCАGGAGСAGCААGC, TLR2-R1 – TGGAAACG-GTGGCACAGGAC; к TLR-4 – TLR4TF6 – GAAGGGGT-GCCТCCATTTCAGC,  TLR4-R6 – GCCTGAGCAGGGTCT-ТСТССА. Уровни экспрессии  мРНК TLR контролируют (стандартизируют) по гену GАPTAH (GAPDH-F1 — TGC-MTCCTGCACCACCAACT; GAPDH-F2 – YGCCTGCTTCAC- САССТТС) за счет сходной экспрессии этого гена в тканях человеческого репродуктивного тракта [11].

В настоящее время с помощью данных методов были проведены десятки исследований в области изучения Толл-подобных рецепторов при различных заболеваниях человека. Примером может служить работа «Экспрессия Толл-подобных рецепторов в носовых полипах и на клетках периферической крови у больных полипозным риносинуситом», в которой проведён сравнительный анализ экспрессии рецепторов TLR и NОD-2 в ткани но­совых полипов и на клетках периферической крови и оценена роль этих показателей в патогенезе полипозного риносинусита [10].

Исследователями показано, что в результате исследования из всех изученных TLR и NОD-рецепторов наибольшее патогенетическое значение имеет достоверное усиление экспрессии рецепторов TLR4 и TLR5 на гранулоцитах, моноцитах и лимфоцитах периферической крови и на клетках вос­палительного инфильтрата в носовых полипах, а также достоверное угнетение экспрессии TLR7 на этих же клетках. Известно, что активация врожденного иммунитета, усиление экспрессии TLR влечет за собой множество патофизиологических послед­ствий [12, 13, 14]. В отношении иммунопатогенеза полипозного риносинусита, где бактериальная и грибковая инфекция играет роль триггера иммунного воспаления in situ, наиболее значимые по­следствия заключаются в гиперпродукции провоспалительных цитокинов и хемокинов, что является главным фактором формирования клеточного воспалительного инфильт­рата. Характерна также интенсификация фагоцитарной и антигенпрезентирующей функции клеток макрофагально-моноцитарного ряда, сопровождающаяся гиперпродукцией медиаторов воспаления. Как следствие, развивается и активация системы адаптивного им­мунитета, обеспечивающей развертывание антигенспецифического лимфоцитарного иммунного ответа in situ [16, 13, 14].

В работе [9] авторами разработан подход к оценке компонентов системы TLR у здоровых людей, у пациентов с иммунопатологией (общей вариабельной иммунологической недостаточностью – ОВИН) и при острых патологических процессах неинфекционного генеза на примере острого инфаркта миокарда – ОИМ [9].

Функцио­нальную активность TLR оценивали по выработке ФНО-α моноцитами периферической крови человека в от­вет на лиганды TLR. ФНО-α – один из основных эффекторных цитокинов, обеспечивающих разви­тие воспалительной реакции. В предложенном методе авторы использовали мононуклеарные клетки, а не цельную кровь, так как растворимые ингибиторы TLR, цитокины, предсуществующие в плазме, могут негативно вли­ять на оценку функций TLR.

В результате исследований было показано, что мононуклерные клетки больных ОВИН характеризуются низким приростом уровня ФНО-α в ответ на лиганды TLR2, 6, 4 и 5 in vitro. Это может приводить к ослаблению защитных функций организма у этих больных при повторном инфицировании in vivo. При развитии острых патологических состоя­ний, таких как ОИМ, важную роль играют клетки врожденного иммунитета – нейтрофилы, макро­фаги, а также провоспалительные цитокины. Их экспрессия может быть индуцирована при актива­ции клеток через рецепторы врожденного иммунитета. При изу­чении спонтанной и индуцированной лигандами TLR выработки ФНО-α мононуклеарными клетками больных ОИМ, авторами было показано, что прогностическим признаком неблагоприят­ного исхода заболевания может слу­жить дополнительное увеличение выработки ФНО-α мононуклеарными клетками больных в ответ на лиган­ды TLR ЛПС и зимозан к 14-м суткам после раз­вития ОИМ в сравнении с индуцированной выра­боткой ФНО-α в 1-е сутки заболевания [9].

В работе [11] изучалась взаимосвязь уровней мРНК TLR2 и TLR4 с изменениями иммуноглобулинового профиля урогенитального тракта при урогенитальном хламидиозе у женщин.

Авторами была установлена взаимосвязь иммуноглобулинового профиля и экспрессии мРНК рецепторов врожденного  иммунитета клеток цервикального канала (ЦК) в патогенезе урогенитального хламидиоза (УГХ). Показано, что уровень IgG, IgM, IgA, slgA, а также экспрессия рецепторов TLR2 и TLR4 опреде­ляют и характеризуют течение инфекционного процесса, выраженность клинических проявлений и исход заболевания.

Повы­шение уровня экспрессии TLR2 и TLR4 в сочетании с повышением локального синтеза slgA мо­жет способствовать развитию преимущественно локального воспаления и благоприятному исходу заболевания. Как считают исследователи, данные показатели могут использоваться в ка­честве дополнительных критериев в оценке формы хламидийного процесса и остроты его протекания.

В работе [20] изучалась роль Толл-подобных рецепторов в разви­тии иммунного воспаления в коже у больных псориасом. Изучение количе­ства и распределения толл-подобных рецепторов TLR2, TLR4 и TLR9 в структурах кожи про­водилось иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител. Авторами установлена по­вышенная экспрессия  TLR2 и TLR4 на клетках эпидермиса и на эндотелиальных клетках сосудов больных псориасом, при отсутствии экспрессии TLR9. По мнению авторов, это способствует развитию хронических воспалительных реакций.

В работе [21] изучалась ассоциация полиморфизма в генах TLR2 и TLR9 с преждевременными родами инфекционного генеза и внутриутробным инфицированием. Полиморфные маркеры в гене TLR2 были определены в клиническом материале с помощью ПЦР, полиморфный маркер в гене TLR9 был определен с помощью ПЦР в режиме реального времени. Показано, что аллель Arg полиморфного маркера Arg753Gln гена TLR2 был ассоциирован с внутриутробной инфекцией. Другой аллель А полиморфного маркера A2848G гена TLR9 ассоциирован со срочными родами при урогенитальной инфекции.

В работе [22] суммированы материалы о роли Toll-подобных рецепторов (TLR) и их лигандов в патогенезе атеросклероза. Бактериальные липополисахариды (ЛПС), могут взаимодействуя с TLR4, могут индуцировать формирование атеросклеротических повреждений в артериальной стенке. Риск развития атеросклероза снижается при мутационном повреждении TLR4. Другие микробные лиганды и белки теплового шока также могут принимать участие в индукции атеросклероза. Предложена единая теория атерогенеза, согласно которой индукция и прогрессирование атерогенеза является побочным эффектом взаимодействия экзогенных и эндогенных лигандов с TLR [22].

В работе [23] изучалась TLR-опосредованная функциональная активность мононуклеарных клеток периферической крови детей с различными формами нейтропении. Авторами установлено, что лиганды TLR2, TLR4, TLR5 обладали повышенной стимулирующей активностью на продукцию ФНОα МНК детей с врожденной нейтропенией и не влияли на МНК детей с иммунной нейтропенией. У детей с иммунной формой нейтропении выявили значительное повышение стимулированной выработки ИФНα в ответ на лиганды TLR3, TLR8 и TLR9. Авторы считают, что выявленные изменения TLR-опосредованной функциональной активности МНК у детей с различными формами нейтропении могут иметь существенное значение в развитии и течении инфекций у этих больных.

В работе [24] определялась экспрессия TLR в селезенке и лимфатических узлах мышей при мукозальных методах иммунизации. Иммунизацию мышей поликомпонентной вакциной Иммуновак проводили мукозально и подкожно. На основе полученных данных авторы полагают, что различная степень сенсибилизации при разных путях введения одних и тех же препаратов предопределена уже на этапе взаимодействия лиганда с TLR.

В работе [25] изучалось значение экспрессии TLR для выбора фармакологической коррекции патологии шейки матки и эндометрия. После лечения нуклеосперматом натрия было зарегистрировано повышение частоты клеток, экспрессирующих TLR4 и TLR9 типов в исследуемом материале, а также снижение количества вируса папилломы человека высокого онкогенного риска.

В работе [26] изучалось влияние ингибитора циклооксигеназы – лорноксикама на опосредованную TLR выработку провоспалительных и противовоспалительных цитокинов мононуклеарами периферической крови здоровых доноров и больных с острым панкреатитом. Показано, что лорноксикам ингибирует TLR-опосредованную выработку как провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, 6, 8, 12, ФНОα), так и противовоспалительного цитокина ИЛ-10 этими клетками. Применение лорноксикама у больных с острым панкреатитом на начальном этапе заболевания приводило к снижению выработки ФНОα мононуклеарами периферической крови в ответ на ЛПС и, следовательно, к снижению эффекторных функций TLR4 и TLR1/2 у этих больных, что уменьшает риск развития осложнений.

Определение экспрессии TLR и их функцио­нальной активности является начальным этапом в оценке системы TLR у человека. Для получения полной информации о функционировании систе­мы TLR необходима комплексная оценка всех ее звеньев. Подобный подход был сформулирован ра­нее для оценки иммунного статуса по патогенети­ческому принципу: предлагалось оценивать различные этапы функционирования иммунной сис­темы [19].  Дальнейшие этапы оценки системы TLR должны включать анализ всех остальных компо­нентов системы TLR: оценку экспрессии молекул, участвующих в трансдукции сигнала, факторов транскрипции и т. д. Это позволит уточнить и ло­кализовать молекулярные дефекты нарушений в системе врожденного иммунитета, а также оценить их роль в патогенезе широкого круга заболеваний.

Большой вклад в изучении этой проблемы могут внести экспериментальные исследования с использованием трансгенных и генно-нокаутированных мышей с различными генными дефектами для того, чтобы лучше определить влияние экспрессии и полиморфизма TLR на предрасположенность к различным, в том числе инфекционным заболеваниям. Представляет также определенный интерес изучение индивидуальных путей, в которых используются специфические адаптерные белки для каждого TLR, так как это должно расширить наши представления о реакциях организма на различные лиганды TLR [9].

Литература

  1. Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета. Иммунология 2005; 26 (6): 368-376.
  2. Werling D., Jungi T.W. TLR liking innate and adaptive immune response. Vet. Immunol. Immunopathol. 2003; 91: 1-12
  3. Rakoff-Nahoum S., Paglino J., Eslami-Varzaneh F. et al. Recognition of commensal microflora by TLRs is required for intestinal homeostasis. Cell 2004; 118: 229-241.
  4. Zarember K., Godowski P. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation  of Toll-like receptor mRNAs in leucocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J.Immunology 2002; 168:554-561.
  5. Harter L., Mica L., Stocker R. et al. Shock, 2004, 5: 403-409.
  6. Li Liwu Curr. Drug Targets-inflamm. Allergy, 2004, 3: 81-86.
  7. Vandenbulcke L., Bachert C., Cauwenberge P.V. et al. Int. Arch. Allergy Immunol., 2006, 139: 159-165.
  8. Picard C., Puel A., Bonnet M. et al. Science, 2003, 299: 2076-2079.
  9. Л.В.Ковальчук, М.В.Хореева и др. Рецепторы врожденного иммунитета: подходы к количественной и функциональной оценке TLR человека. Иммунопатология и клиническая иммунология 2008, 223-227.
  10. М.З.Саидов, Х.Ш.Давудов и др. Экспрессия TLR в носовых полипах и на клетках периферической крови у больных полипозным риносинуситом. Иммунология, 2008, 5: 272-278.
  11. В.А.Алешкин, А.В.Караулов и др. Связь уровней мРНК TLR2 и TLR4 с изменениями иммуноглобулинового профиля урогенитального тракта при урогенитальном хламидиозе у женщин.
  12. Хаитов Р.М., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Биология рецепторов врожденной иммунной системы. Физиол. и патол. Иммунной системы, 2008, 6: 3-28.
  13. Pitzurra L., Bellocchio S., Nocentini A. et al. Antifungal immune reactivity in nasal polyposis. Infect. And Immun., 2004, 12: 7275-7281.
  14. Wang J., Matsukura S., Watanabe S. et al. Involvement  of TLRs in the immune response of nasal polyp epithelial cells. Clin. Immunol., 2007, 3: 345-352.
  15. Huvenne W., van Bruaene N., Zhang N. et al. Chronic rhinosinusutis with and without nasal polyps: what is the difference? Curr. Allergy Asthma Rep., 2009, 3: 213-220.
  16. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Пащенков М.В. Значение функциональной активности Толл-подобных рецепторов и других рецепторов врожденной иммунной системы в физиологии почек. Российский физиологический журнал, 2007, 5: 505-520.
  17. Мedzhitov R. Recognition of microorganisms and activation of immune response. Nature, 2007, 18: 819-826.
  18. Uematsu S., Akira S. TLRs and innate immunity. J. Mol. Med. 2006, 84: 712-725.
  19.  Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Актуальные проблемы оценки иммунной системы человека. Иммунология, 1990, 3: 4-7.
  20. Катунин О.Р., Резайкина А.В., Колыханова О.И. «Роль распознающих рецепторов в инициации иммунного воспаления в коже больных псориазом». Вестник дерматологии и венерологии, 2010, 5: 84-91.
  21. Ганковская О.А. «Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов TLR2 и TLR9 с преждевременными родами и внутриутробным инфицированием». Медицинская иммунология, 2010, 1-2: 87-94.
  22. Глинцбург А.Л., Лиходед В.Г., Бондаренко В.М. «Экзогенные и эндогенные факторы в патогенезе атеросклероза. Рецепторная теория атеросклероза». Российский кардиологический журнал 2010, 2: 92-96.
  23. Мамедова Е.А., Ковальчук Л.В., Финогенева Н.А., Половцева Т.В., Грачева Л.А., Голдырева Н.Г., Хорева М.В., Фетисова Л.Я., Никонов А.С. Опосредованная TLR функциональная активность мононуклеарных клеток у детей с нейтропениями. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010, 2: 64-68
  24. Ахматова Н.К., Егорова Н.Б., Ахматов Э.А., Курбатова Е.А., Семенова И.Б., Чертов И.В., Семенов Б.Ф., Зверев В.В. Экспрессия TLR в селезенке и лимфатических узлах при мукозальных методах иммунизации. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010, 1: 50-54.
  25. Прошин С.Н., Глушаков Р.И., Шабанов П.Д, Сайковская Л.А., Семенова И.В.,  Тапильская Н.И. Значение экспрессии TLR для выбора фармакологической коррекции патологии шейки матки и эндометрия. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2011, 6(1): 91-97.
  26. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Никонова А.С., Греченко В.В., Агапов М.А.,    Индраков В.А., Леоненко И.В., Горский В.А., Грачева Л.А. Корригирующее действие  ингибитора циклооксигеназы на функциональное состояние мононуклеарных клеток, экспрессирующих TLR. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010,1:45-50.

 

Кейбір аурулар кезінде Толл-тәрізді рецепторлардың экспрессиясын зерттеу

Д.М.Самарканова, А.А.Шортанбаев, Б.Б.Бижигитова, С.В.Кожанова

Шолуда туа біткен иммунитеттің мембранасымен әсерлескен рецепторлар – Толл-тәрізді рецепторлар туралы негізгі түсініктеме, оларды анықтаудың негізгі әдістері, экспрессиясының клиникалық зерттеулері, сонымен қатар олардың көмегімен алынған нәтижелердің негізгі анықтаулары қарастырылған. Зерттеулурдің болашағы TLR жүйесінің қызметі туралы толық мағлұмат алуға негізделген, сонымен қатар оның барлық звеноларын кешенді бағалау қажет. Бұл туа біткен иммунитет жүйесінің бұзылыстарының молекулярлы дефектілерін нақтылауға жағдай туғызып отыр, сонымен қатар көптеген аурулардың патогенезінде олардың қызметін бағалауға мүмкіндік беріп отырады.
 

Studying the expression of Toll-like receptors in certain diseases

Samarkanova D.M., Shortanbaev A.A., Bizhigitova B.B., Kozhanova S.V.,

In this review article discusses the basic concepts of membrane-associated receptors of innate immunity – Toll-like receptor, basic methods are the definition of their expression, used in clinical trials, as well as obtained with their help. Prospects for future research are based on full information about the functioning of the system we have – TLR, also require a comprehensive assessment of all its links. It will clarify and localized molecular defects of violations in the innate immune system, and to assess their role in the pathogenesis of a wide range of diseases.

Изучение экспрессии толл-подобных рецепторов при некоторых заболеваниях

Д.М.Самарканова, А.А.Шортанбаев, Б.Б.Бижигитова, С.В.Кожанова

Казахский Национальный медицинский университет им. С.Д.Асфендифрова

Поисковые слова: